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色谱仪技术简介
发布时间:2009-09-14   点击次数:2764次

主要经营:气相色谱仪液相色谱仪气体发生器色谱柱色谱仪维修


色谱法是1906年俄国植物学家Michael Tswett将含有有色的植物叶子色素和溶液通过装填有白垩粒子吸附剂的柱子,企图分离它们时而发现并命名的。各种色素以不同的速率通过柱子,从而彼此分开。分离开的色素形成不同的色带而易于区分,由此得名为色谱法(Chromatography),又称层析法。其后的一个重大进展是1941年Martin和Synge 发现了液-液(分配)色谱法[Liquid-Lipuid(partition)Chromatography,简称LIC]。 他们用覆盖于吸附剂表面的并与流动相不混溶的固定液来代替以前仅有的固体吸附剂。试样组分按照其溶解在两相之间分配。Martin和Synge因为这一工作而荣获1952 年诺贝尔化学奖。在使用柱色谱的早期年代,可靠地鉴定小量的被分离物质是困难的,所以研究发展了纸色谱法(Paper Chromatography,简称PC)。在这种“平面的”技术中,分离主要是通过滤纸?#31995;?#20998;配来实现的。然后由于充分考虑了平面色谱法的?#35834;?#32780;发展了薄层色谱法(Thin-Layer Chromatography,简称TLC),在这种方法中,分离系在涂布于玻璃板或某些坚硬材料?#31995;?#34180;层吸附剂上进?#23567;?
     在Stah-l于1958年进行?#21496;?#20856;性的工作将技术和所用材料加以标准化之后, 薄层色谱法方赢得了声誉。为了帮助提高纸色谱法或薄层色谱法对离子化合物的分离效率,可以向纸或板施加电场。这种改进了方法分别?#35889;?#32440;?#31995;?#27891;或薄层电泳。


        新近发展起来的色谱法
    
     气相色谱法是Martin和James于1952 年首先描述的,现已成为所有色谱法中zui和zui广泛使用的一种方法,它特别适用于气体混合物或挥发性液体和固体,即便对于很复杂的混合物,其分离时间也仅为几分钟左右,这已属司空见惯。高分辩率、分析迅速和检测灵敏等?#38050;钟诺?#20043;综合使气相色谱法成了几乎每个化学实验室要采用的一种常规方法。近年来,因为新型液相色谱仪和新型柱填?#31995;?#21457;展以及对色谱理论的更深入了解,?#31181;?#26032;引起对密闭柱液相色谱法的兴趣。液相色谱法(High-Performance Liquid Chromatography,简称HPLC)迅速成为与气相色谱法一样广泛使用的方法,对于迅速分离非挥发性的或热不稳定的试样来说,液相色谱法常常是更可取的。
     色谱法分类
     色谱法有多种类型,也有多种分类方法。
    
     (一)按两相所处的状态分类
    
     液体作为流动相,称为“液相色谱”(liquid chromatograp-hy);用气体作为流动相,称为“气相色谱”(gas
     chromatogr-aphy)。固定相也有两种状态,以固体吸附剂作为固定相和以附载在固体?#31995;?#28082;体作为固定相,所以层析法按两相所处的状态可以分为:
    
     液-固色谱(liquid-solid chromatography)
     液-液色谱(liquid-liquid chromatography)
     气-固色谱(gas-solid chromatography)
     气-液色谱(gas-liquid chromatography)
     (二)按层析过程的机理分类
     吸附层析(adsorption chromatography )利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异,达到分离鉴定的目的。
    
     分配层析(partition chromatography)利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数(或溶解度)不同,而使之分离的方法。
     离子交换层析(ion-exchange chromatography )利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同,而进行分离的方法。凝胶层析(gelchromatography)利用某些凝胶对于不同组分因分子大小不同而阻滞作用不同的差异,进行分离的技术。
    
     (三)按操作形式不同分类
     柱层析(colum chromatography)将固定相装于柱内,使样品沿一个方向移动而达到分离。纸层析(paper chrmatography)用滤纸作液体的载体(担体support),点样后,用流动相展开,以达到分离鉴定的目的。薄层层析(thin layper chromatography)将?#23454;?#31890;度的吸附剂铺成薄层,以纸层析类似的方法进?#24418;?#36136;的分离和鉴定。
     吸附色谱法
     吸附色谱法常叫做液-固色谱法(Liquid-Solid
     Chromatography,简称LSC),它是基于在溶质和用作固定固体吸附剂?#31995;?#22266;定活性位点之间的相互作用。可以将吸附剂装填于柱中、覆盖于板上、或浸渍于多孔滤纸中。吸附剂是具有大表面积的活性多孔固体,例如硅胶、氧化铝和活性炭等。活性点位例如硅胶的表面硅烷醇,一般与待分离化合物的极性官能团相互作用。分子的非极性部分(例如烃)对分离只有较小影响,所以液-固色谱法十?#36136;?#20110;分离不同种类的化合物(例如,分离醇类与芳香烃)。
     分配色谱法
     在分配色谱法(也称体液-液色谱法)中,溶质分子在两种不相混溶的液相即固定相和流动相之间按照它们的相对溶解度进行分配。固定相均匀地覆盖于惰性载体─多孔的或非多孔的固体细粒或多孔纸上(纸上谱)。为避免两相的混合,两种分配液体在极性上必须显著不同。若固定液是极性的(例如乙二醇),流动相是非极性的(例如乙烷),那?#37255;?#24615;组分将较强烈的被保留。这是通常的操作方式。另一方面,若固定相是非极性的(例如癸烷),流动相是极性的(例如水),则极性组分易分配于流动相,从而洗脱得较快。后一种方法(它有相反的极性)?#35889;?#20026;反相液─液色谱法。由于溶解度差别的细微效应,所以液─液色谱法很适于分离同系物的同分异构体。在液─液色谱法中,固定相几乎都被化学键合在载体物质上,而不是机械覆盖在它的表面。这种色谱法?#35889;?#38190;合相色谱法(Bonded-Phase Chromatography,简称 BPC)。这种方法的机理尚不清楚,可能是分配机理,?#37096;?#33021;是吸附机理, 视实验条件而定。液相色谱法中,键合相色谱法的应用?#23545;?#36229;过所有其他模式。
     离子交换色谱法
     Sober 和 Peterson于1956年将离子交换基团结?#31995;较?#32500;素上,制成了离子交换纤维素,成功地应用于蛋白质的分离。从此使生物大分子的分级分离方法取得了迅速的发展。离子交换基团不但?#23665;岷系较?#32500;上, 还?#23665;岷系?#20132;联葡聚糖(S-ephadex)和琼脂糖凝胶(Sepharose)上。
     近年来离子交换色谱技术已经广泛应用于蛋白质、酶、核酸、肽、寡核苷酸、病毒、噬菌体和多糖的分离和纯化。它们的?#35834;?#26159;:⑴具有开放性支持骨架,大分子可以自由进入和迅速扩散,故吸附容量大。⑵具有亲水性,对大分子的吸附不大牢固,用温和条件使可以洗脱,不致引起蛋白质变性或酶的失活。⑶多孔性,表面积大、交换容量大,回?#31456;?#39640;,可用于分离和制备。
     一、基本理论
    
     离子交换剂通常是一种不溶性高分子化合物,如树脂,纤维素,葡聚糖,醇脂糖等,它的分子中含有?#23665;?#31163;的基团,这些基因在水溶液中能与溶液中的其它阳离子或阴离子起交换作用。虽然交换?#20174;?#37117;是平衡?#20174;Γ?#20294;在层析柱上进行时,由于连续添?#26377;?#30340;交换溶液,平衡?#27426;?#25353;正方向进行,直至完全。因此可以把离子交换剂?#31995;?#21407;子离子全部洗脱下来,同理,当?#27426;?#37327;的溶液通过交换柱时,由于溶液中的离子?#27426;?#34987;交?#27426;?#27874;度逐减少,因此?#37096;?#20197;全部被交换并吸附在树脂上。如果有两种以?#31995;?#25104;分被交换吸着在离子交换剂上,用洗脱液洗脱时,在被洗脱的能力则决定于各自洗?#20174;?#30340;平衡常数。蛋白质的离子交换过程有两个阶段──吸附和解吸附。吸附在离子交换剂?#31995;?#34507;白质可以通过改变pH使吸附的蛋白质失去电荷而达到解离但更多的是通过增加离子强度,使加入的离子与蛋白质竞争离子交换剂?#31995;?#30005;荷位置,使吸附的蛋白质与离子交换剂解开。不同蛋白质与离子交换剂之间形成电键数目不同,即亲和力大小有差异 ,因此只要选择?#23454;?#30340;洗脱条件便?#23665;?#28151;合物中的组分逐个洗脱下来,达到分离纯化的目的。
     二、离子交换的分类及常见种类
     (一)分类
     离子交换剂分为两大类,即阳离子交换剂和阴离子交换剂。各类交换剂根据其解离性大小,还可分为强、弱两种,即 强酸剂 阳离子交换剂
      弱酸剂 ?#32771;?#22411; 阴离子交换剂 弱硷型 。
     1.阳离子交换剂
       阳离子交换剂中的?#23665;?#31163;基因是磺酸(-SO3H)、磷酸(-PO3H2)、 ?#20154;幔–OOH)?#22836;?#32671;基(-OH)?#20154;?#24615;基。
     某些交换剂在交换时?#20174;?#22914;下:
     强酸性:R-SO3 -H+ + Na+ R-SO3- Na+H+
     弱酸性:R-COOH+Na+ R-COONa +H+
     国产树脂中强酸1×7(上海树脂#732)和国外产品Dowex 50、Zerolit 225等都于强酸型离子交换剂。
     2.阴离子交换剂
       阴离子交换剂中的?#23665;?#31163;基因是伯胺、(-NH2)、仲胺(-NHCH3)、叔胺[N-(CH3)2]和季胺[-N(CH3)2]等硷性基团。某些交换?#20174;?#22914;下:
     ?#32771;?#24615;:R-N+(CH3)2 H·OH- +Cl R-N+(CH3)2 Cl+OH-
     弱硷性:R-N+(CH3)2 H·OH- +Cl R-N+(CH3)2 HCl+OH-
     ?#32771;?#24615;#201号国产树脂和国外Dowex1、Dowex2、ZerolitFF等都属于?#32771;?#22411;阴离子交换剂。
     (二)种类
     1.纤维素离子交换?#31890;?#38451;离子交换剂有羟甲基纤维素(CM-纤维素), 阴离子交换剂有氯代三乙胺纤维纱(DESE-纤维素)。
     2.交联葡聚糖离子交换?#31890;?#26159;将交换基因连接到交联葡聚糖?#29616;?#25104;的一类交换?#31890;?#22240;而既具有离子交换作用,又具有分子筛效应,是一类广泛应用的色谱分离物质。常用的Sephadex离子交换剂也有阴离子和阳离子交换剂两类。阴离子交换剂有DEAE-Sephadex
     A-25,A-50和QAE- Sephadex A25 , A50 ; 阳离子交换剂有CM-Sephaetx
     C-50,C-50和Sephadex
     C-25,C-50。阴离子交换剂用英文字头A,阳离子交换剂的英文字头是C。英文字后面的数字表示Sephadex型号。
     3.琼脂糖离子离交换?#31890;?#26159;将DESE-或CM-基团附着在Sepharose CL-6B
     上形成,DEAE-Sephades(阴离子)和CM-Sepharose(阳离子),具有硬度大,
     性质稳定,凝胶后的流速好,分离能力强等?#35834;恪?br />     三、实验操作
    
     (一)交换剂的处理,再生与转型
       新出厂的树脂是干树脂,要用水浸透使之充分吸水膨胀。因其含有政绩一些杂质,所要要用水、酸、硷洗涤。一般?#20013;?#22914;下:新出厂干树脂用水浸泡2
     小时后减抽压去气泡,倾去水,再用大量无离子水洗至澄清,去水后加4倍量2N HCl搅抖4小时,除去酸液,水洗到中性,再加4倍量2N
     NaOH搅抖4小时,除硷液,
     水洗到中性备用。将树脂带上所希望的某种离子的操作称为转型。如希望阳树脂带Na+,则用4倍量NaOH搅拌浸泡2小时以上;如希望树脂带H+,可用HCl处理。阴树脂转型也同样,若希望带Cl-则用HCl,希望带OH-则用NaOH。用过的树脂使其恢复原状的方法称为再生。并非每次再?#27426;?#29992;酸、硷液洗涤,往往只要转型处理就行了。
     (二)柱上操作
     ⑴交换剂装柱zui简单的交换层析柱可用硷式滴定管代替。处理过的树脂放入烧杯,?#30001;?#37327;水边搅拌边倒入保持垂直的层析管中,使树脂缓慢?#20004;怠?#20132;换剂在柱内必须分布均?#21462;?br />     ⑵上样向层析柱内倾入样品液
     ⑶洗脱与收集
       不同样品选用的洗脱液不同。原则是用一种比吸着物质更活泼的离子,把吸着物交换出来。由于被吸?#35834;?#29289;质往往不是我们所要求的单一物质,因此除了正确选择洗脱液外还采控制流速?#22836;?#24067;收集的方法来获得所需的单一物质。
     胶色谱法
       凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分技术,由于设备简单、操作方便,不需要有机溶?#31890;?#23545;高分子物质有很高的分离效果。目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分?#29992;?#30123;学以及医学等有关领域广泛采用,不但应用于科学实验研究,而且已经大规模地用于工业生产。
     一、基本理论
     (一)分子筛效益
       一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时,各分子在柱内同时进行着两种不同的运动:垂直向下的移动和无定向的扩散运动。大分子物质由于?#26412;?#36739;大,不易进入凝胶颗粒的微孔,而只能分布颗粒之间,所以在洗脱时向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外,还可以进入凝胶颗粒的微孔中,即进入凝胶相内,在向下移动的过程中,从一个凝?#32791;?#25193;散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒,如此?#27426;系?#36827;入和扩散,小分子物质的下移速度落后于大分子物质,从而使样品中分子大的先流出色谱柱,中等分子的后流出,分子zui小的zui后流出,这种现象叫分子筛效应。具有多孔的凝胶就是分子筛。各种分子筛的孔隙大小分布有?#27426;ǚ段В?#26377;zui大极限和zui小极限。分子?#26412;?#27604;凝胶zui大孔隙?#26412;?#22823;的,就会全部被排阻在凝胶颗粒之外,这种情况叫全排阻。两种全排阻的分子即使大小不同,也不能有分离效果。?#26412;?#27604;凝胶zui小孔?#26412;?#23567;的分子能进入凝胶的全部孔隙。如果两种分子都能全部进入凝胶孔隙,即使它们的大小有差别,也不会有好的分离效果。因此,?#27426;?#30340;分子筛有它?#27426;?#30340;使用?#27573;А?#32508;上所述,在凝胶色谱中会有三种情况,一是分子很小,能进入分子筛全部的内孔隙?#27426;?#26159;分子很大,完全不能进入凝胶的任?#25991;?#23380;隙;三是分子大小适中,能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分。大、中、小三类分子彼此间较易分开,但每种凝胶分离?#27573;?#20043;外的分子,在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同,但同属于凝胶分离?#27573;?#20869;各种分子,在凝胶床中的分布情况是不同的:分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内,而分子的可进入较多的凝胶颗粒内,这样分子较大的在凝胶?#26448;?#31227;动距离较短,分子较小的移动距离较长。于是分子较大的先通过凝胶床而分子较小的后通过凝胶?#29627;?#36825;样就利用分子筛?#23665;?#20998;子量不同的物质分离。另外,凝胶本身具有三维网状结构,大的分子在通过这种网状结构?#31995;目?#38553;时阻力较大,小分子通过时阻力较小。分子量大小不同的多种成份在通过凝胶床时,按照分子量大小“排队,凝胶表现分子筛效应。
     (二)色谱柱的重要参数
     ⑴柱体积:柱体积是?#25913;?#33014;装柱后,从柱的?#35013;?#21040;凝胶沉积表面的体积。在色谱柱中充满凝胶的部分称为凝胶?#29627;?#22240;引柱体积又称“床”体积,常用Vt
     表示。
     ⑵外水体积:色谱柱内凝胶颗粒间隙,这部分体积称外水体积,亦称间隙体积,常用Vo表示。
     ⑶内水体积:因为凝胶为三维网状结构,颗粒内部仍有空间,液体可进入颗粒内部,这?#22836;?#38388;隙的总和为内水体积,又称定相体积,常用Vi表示。
     不包括固体支持物的体积(Vg)。
     ?#30830;?#27927;脱体积:是指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液有体积,常用Ve
     表示。当使用样品的体积很少时,(与洗脱体积比较可以忽略不计),在洗脱图中,从加样到峰顶位置所用洗脱液体积为Ve。
     当样品体积与洗脱体积比较不能忽略时,洗脱体积计算可以从样品体积的一半到峰顶位置。当样品很大时,洗脱体积计算可以从应用样品开始到洗脱峰升高的弯曲点(或半高处)。
    
    
    
     二、凝胶的种类及性质
     (一)交联葡聚糖凝胶(Sephadex)
     ⑴Sephadex
     G交联葡聚糖的商品名为Sephndex,不同规格型?#35834;?#33889;聚糖用英文字母G表示,G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。例如,G-25为?#38752;?#20957;?#21495;?#32960;时吸水2.5克,同样G-200克?#38752;?#21315;胶吸水20克。交联葡聚糖凝胶的种类有G-10,G-15,G-25,G-50,G-75,G-100,G-150,和G-200。因此,“G”?#20174;常?#20957;胶的交联程度,膨?#32479;?#24230;及分部?#27573;А?br />     ⑵Sephadex LH-20,是─Sephadex G-25的羧丙基衍生物, 能溶于水及亲脂溶?#31890;?#29992;于分离不溶于水的物质。
     (二)琼脂糖凝胶:
       商品名很多,常见的有,Sepharose(瑞典,pharmacia ),Bio-Gel-A(美国Bio-Rad)等。琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构,网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情况下,它的结构是稳定的,可以在许多条件?#29575;?#29992;(如水,pH4-9?#27573;?#20869;的?#31283;?#28082;)。琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化,也不能高压消毒,可用化学灭菌活处理。
     (三)聚丙烯酰胺凝胶:
       是一种人工合成凝胶,是以丙烯酰胺为单位,
     由甲叉双丙烯酰?#26041;?#32852;成的,经干燥粉碎或加工成形制成粒状,控?#24179;?#32852;剂的用量可制成各?#20013;禿诺?#20957;胶。交联剂越多,孔?#23545;?#23567;。聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶-P
     (Bio-Gel P),由美国Bio-Rod厂生产,型号很多,从P-2至P-300共10种,P
     后面的数字再乘1000就相当于该凝胶的排阻限度。
     (?#27169;?#32858;苯乙烯凝胶商品为Styrogel , 具有大网孔结构,
     可用于分离分子量1600到40,000,000的生物大分子,适用于有机多聚物,分子量测定和脂溶性天然物的分级,凝胶机械强度好,洗脱?#37327;?#29992;甲基?#29756;俊?br />     三、实验技术
     (一)层析柱
     层析柱是凝胶层析技术中的主体,一般用玻璃管或有机玻璃管。层析柱的?#26412;?#22823;小不影响分离度,样品用量大,可加大柱的?#26412;叮?#19968;般制备用凝胶柱,?#26412;?#22823;于2厘米,但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上。此外,
     ?#26412;?#21152;大,洗脱液体体积增大,样品稀释度大。分离?#28909;?#20915;于柱高,为分离不同组分,凝胶柱床必须有适宜的高度,分离度与柱高的平方根相关,但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞,一般不超过1米。分族分离时用短柱,一般凝胶柱长20-30厘米,柱高与?#26412;?#30340;比较5:1─10:1,凝胶床体积为样品溶液体积的4-10倍。
     分级分离时柱高与?#26412;?#20043;线为20:1─100:1,常用凝胶柱有50×25厘米,10×25厘米。层析柱滤板下的死体积应尽可能的小,如果支掌滤板下的死体积大,被分离组分之间重新混?#31995;?#21487;能性就大,其结果是影响洗脱峰形,出现拖尾出象,降?#22836;?#36777;力。在分离时,死体积不能超过总床体积的1/1000。
     (二)凝胶的选择 根据所需凝胶体积,估计所需?#23665;?#30340;量。 一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的2倍,例如Sephadex
     G-20的吸水量为20,1 克Sephadex
     G─200吸水后形成的凝胶体积约40ml。凝胶的粒度?#37096;?#24433;响层析分离效果。粒度细胞分离效果好,但阻力大,流速慢。一般实验室分离蛋白质采用100-200号?#25913;?#30340;的Sephadex
     G-200效果好, 脱盐用Sephadex G-25、G-50,用粗粒,短柱,流速快。
     (三)凝胶的制备
     商品凝胶是干燥的颗粒使?#20204;?#38656;直接在欲使用的洗脱液中膨胀。为了加速膨胀,可用加热法,即在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温?#20004;?#27832;,这样可大大中速膨胀,通常在1-2小时内即可完成。特别是在使用软胶时,
     自然膨胀需24小时至数天,而用加热法在几小时内就可完成。这种方法不但节约时间,而?#19968;?#21487;消毒,除去凝胶中污染的细菌和排除?#32791;?#30340;空气。
     (?#27169;?#26679;品溶液的处理 样品溶液如有沉淀应过滤或离心除去,如含脂类可高速离心或通过Sephadex
     G-15短柱除去。样品的粘度不可大,含蛋白为超过4%,粘度高影响分离效果。上柱样品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定。分离蛋白质样品的体积为凝胶床的1-4%(一般约0.5-2ml),进行分族分离时样品液可为凝胶床的10%,在蛋白质溶液除盐时,样品可达凝胶床的20-30%。
     分级分离样品体积要小,使样品层尽可能窄,洗脱出的峰形较好。
     (五)防止微生物的污染 交联葡聚糖和琼脂糖都是多糖类物质,防止微生物的生长,在凝胶层析中十分重要,常用的抑菌剂有:
     ?#35834;?#27688;钠(NaN3)在凝胶层析中只要用0.02%叠氮钠已足够防止微生物的生长,叠氮钠易溶一水,在20℃时约为40%;它不与蛋白质或碳水化合物相互作用,因此叠氮钠不影响抗体活力;不会改变蛋白质和碳水化合物的层析我特性。叠氮钠可干扰荧光标记蛋白质。
     ⑵可?#28382;猍Cl3C-C(OH)(CH3)2]在凝胶层析中使用浓度为0.01-0.02%。在微酸性溶液中它的杀菌效果zui佳,在?#32771;?#24615;溶液中或温度高于60℃时易引起分解而失效。
     ?#19988;一?#27742;代巯基水杨酸钠 在凝胶层析中作为抑菌剂使用浓度为0.05-0. 01%。在微酸性溶液中zui为有效。重金属离子可使?#19968;?#20195;巯基的物质结合,因而包含疏基的蛋白质可在不同程度上降低它的抑菌效果。
     ?#32570;交?#27742;代盐
     在凝胶层析中使用浓度为0.001-0.01%。在微碱性溶液中?#20013;?#26524;zui佳,长时间放置时可与卤素、硝酸根离子作用而产生沉淀?#25442;?#21407;?#37327;?#24341;起此化合物分解;含疏基的物质亦?#23665;?#20302;或?#31181;?#23427;的抑菌作用。
     亲和色谱法
     一、基本理论
     (一)原理
       在生物体内,许多大分子AKSJDHFKLSDFHKLSDJ具有与某些相对应的专一分子可逆结?#31995;?#29305;性。例如抗原和抗体、酶和底物及辅酶、激素和受体、RNA和其互补的DNA等,都具有这种特性。生物分子之间这种特异的结合能力称为亲和力,根据生物分子间亲和吸附和解离的原理,建立起来的色谱法称亲色谱法。亲和色谱中两个进行专一结?#31995;?#20998;子互称对方为配基。如抗原和抗体,抗原可认为是抗体的配基,反之抗体?#37096;?#35748;为是抗原的配基。将一个水溶性配基在不伤害其生物学功能的情况下与水不溶性载体结合称为配基的固相化。亲和色谱法的基本过程是:
     1.配基固相化。将与纯化对象有专一结合作用的物质,连接在水不溶性载体上,制成亲和吸附剂后装柱(称亲和性)。
     2.亲和吸附。将含有纯化对象的混合物通过亲和柱,纯化对象吸附在柱上,其他物质流出色谱柱。
     3.解吸附。用某种缓冲液或溶液通过亲和柱,把吸附在亲和柱?#31995;?#27442;纯化物质洗脱出来。
     (二)应用?#27573;?br />     亲和色谱可用于?#38109;?#29983;物体系:
     酶:底物、?#31181;?#21058;、辅酶
     抗体:抗原、病毒、细胞
     外源凝集素:多糖、糖蛋白、细胞表面受体、
     细胞核酸:互补碱基序?#23567;?#32452;蛋白、核酸聚合酶 、结?#31995;?#30333;
     激素及维生素:受体、载体蛋白
     细胞:细胞表面特异蛋白、外源凝集素
     亲和色谱的?#35834;?#26159;操作简便、效率高、条件温和,缺点是使用局限性大。
     (三)载体的选择原则
       
       
     用于亲和色谱的理想载体应具有?#38109;?#29305;性:⑴不溶性:不溶于水;⑵渗透性:疏松网状结构,容许大分子自由通过;⑶有?#27426;?#30828;度,zui好为均一的珠状;⑷具有大量可供?#20174;?#30340;化学基团,能与大量配基?#24067;?#36830;接;⑸非特异性吸附能力极低;⑹能抗微生物和酶的?#36136;矗虎?#26377;较好的化学稳定性;⑻亲水性。选择配基根据对纯化大分子的特异性的全面认识。
     选择也的配基有两条标准:
     *是蛋白质和配基之间必须有强的亲和力,解离常数在5mM以上不是好配基;
     相反亲和力太高也是有害的,因为在解离蛋白质──配基复合物时所需的条件就要强烈,这样可能使蛋白质变性。例如用抗生物素蛋白作配基纯化含生物素的羧化酶时,生物素──抗生物素蛋白复合物的解离常数达10-15M,解离时需要pH1.5,6M盐酸胍,在这种条件中。羧化酶大多数已经变性。
     选择配基的第二个标准是,配基必须具有?#23454;?#30340;化学基团,这种基团不参与配基与蛋白质之间特异结合,但可用于活化和载体相连接,同时又不影响配基与蛋白质之间的亲和力。
     (?#27169;?#24120;见载体的特性
     琼脂糖凝胶: 亲水性强,理化性质稳定 (商品名:Sepharose)
     聚丙烯酰胺凝胶: 理化性质稳定,耐有机溶剂及去污?#31890;?抗微生物能力强, 特别适应用配基与提取物亲和力比?#20808;?#30340;物质。
     葡聚糖凝胶: 有良好的化学及物理性质,孔经小。
     纤维素: 非特易吸附?#29616;兀?#24265;价,易得。
     二、实验方法
     亲和色谱分离的方法随每种分离物质的不同而有不同。一般推荐使用的程序如下:
     1选 择 配 基;2选择偶联凝胶;3偶 联 配 基;4装填合适的柱;5平衡(2-3倍体积缓冲液);6应 用 样
     品;7洗涤未结合物质;8洗脱结合物质→除盐;9再生 
     高压液相色谱
       Martin 和
     Synge在1941年就提出相色谱的设想,?#27426;?#30452;到六十年代后期,由于各种技术的发展,液相色谱才付诸实现。这种色谱技术曾被称为高速液相色谱(HighSpeed
     Liquid Chromatography),高压液相色谱(High Parss-ure Lipuid Chromatography),目前使用zui多的名称是液相色谱(High Pe-rformance Liauid
     Chromatography,HPLC)。液相色谱已经广泛地应用,成为一项不可缺少的技术。它的主要?#35834;?#26159;⑴分辩率高于其它色谱法;⑵速度快,十几分钟到几十分钟可完成;⑶重复性高;⑷相色谱柱可反复使用;⑸自动化操作,分析度高。根据分离过程中溶质分子与固定相相互作用的差别,液相色谱可分为四个基本类型,即液-固色谱、液-液色谱、离子交换色谱和体积排阻色谱。液相色谱在生物领域中广泛用于?#38109;?#20135;物的分离和鉴定:⑴?#34987;?#37240;及其衍生物;⑵有机酸;⑶甾体化合物;⑷生物硷;⑸抗菌素;⑹糖类;⑺卟啉;⑻核酸及其?#21040;?#20135;物;⑼蛋白质、酶和多?#27169;虎?#33026;
    
     一、分类
       液相色谱法可分为四个基本类型:即液-固色谱法,键合相色谱法,离子交换色谱法及体积排阻色谱法。
     (一)液-固色谱法
       液-固色谱法通常称吸附色谱法,吸附剂有活性碳,氧化铝和硅胶,在液-固色谱法中用的载体都是硅胶。硅胶对溶质,分子的吸附能力不是平均分布在整个硅脱表面的,在硅胶表面有一些区域与溶质分子强烈相互作用,这些区域为活性位置,硅胶与溶质分子间主要作用是?#25216;?#36317;力氢键及静电相互作用。极性越强,而化合物在硅胶柱?#31995;?#28382;留时间也长。在液-固色谱中,依靠流动相溶剂分子与溶质分子竞争固定相互活性位置,
     从而使溶质从色谱柱上洗脱下来。与硅胶表面活性位置结合力强的溶剂洗脱溶质分子的能力强,因而称强溶?#31890;?#21453;之为弱溶剂。液─固色谱法的特点是适于分离色谱几?#25105;?#26500;体,可用于脂溶性化合物质如磷脂,甾体化合物,脂溶性维生素,前列腺素等。
     (二)键合相色谱法
       键合相色谱法是由液-液色谱法即分配色谱发展起来的。键合相色谱法将固定相?#24067;?#32467;合在载体颗粒上,克服了分配色谱中由于固定相在流动中有微量溶解,及流动相通过色谱柱时的机械冲击,固定相?#27426;纤?#22833;,色谱柱的性质逐渐改变?#28909;?#28857;。键合相色谱法可分为正常相色谱法?#22836;?#30456;色谱法。
     1.正常相色谱法
       在正常相色谱法中?#24067;?#32467;?#31995;?#36733;体?#31995;?#22522;团都是极性基团,如一级?#34987;?#27696;基、二醇基、二甲?#34987;?#21644;二?#34987;?#31561;。流动相溶剂是与吸附色谱中的流动相很相似的非极性溶?#31890;?#22914;庚烷、已烷及异辛烷等。由于固定相是极性,因此流动溶剂的极性越强,洗脱能力也越强,即极性大的溶剂是强溶剂。固定相与流动相的这种关系正好与液-固色谱法相同,称这种色谱法为正常相色谱法。尽管如此,正常相色谱法的分离原理主要根据化合物在固定相及流动相中分配系数的不同进行分离,它不适于分离几?#25105;?#26500;体。
     2.反相色谱法
       在反相色谱法中?#24067;?#32467;?#31995;?#36733;体?#31995;?#22266;定相是一些直链碳氢化合物,如正辛基等。流动相的极性比固定相的极性强。反相色谱法在液相色谱法中应用zui广泛。
     在反相色谱法中,使溶质滞留的主要作用是疏水作用,在液相色谱中又被称为疏溶剂作用。所谓疏水作用即当水中存在非极性溶质时,溶质分子之间的相互作用 、溶质分子与水分子之间的相互作用远小于水分子之间的相互作用,
     因此溶质分子从水中被“挤”了出去。可见反相色谱中疏水性越强的化合物越容易从流动相中挤出去,在色谱柱中滞留时间也长,所以反相色谱法中不同的化合物根据它们的疏水特性得到分离。反相色谱法适于分离带有不同疏水基?#35834;?#21270;合物,亦即非极性基?#35834;?#21270;合物。此外,反相色谱法可用于分离带有不同极性基?#35834;?#21270;合物。可以通过改变流动相的溶剂及其组成和pH,以影响溶质分子与流动相的相互作用,改变它们的滞留?#24418;?#21478;外,反相色谱中水的流动相中占的比例伸缩性很大,可以/从0-100%,从而使反相色谱可用于水溶性、脂溶性化合物的分离。反相色谱法中的固定相是被?#24067;?#32467;?#31995;?#30789;胶载体?#31995;?#30452;链饱和和烷烃,其链的长短不同,zui长的是十八烷基,这也是使用得zui多的固定相。直链饱和烷烃疏水特性随着碳氢链的长度而增加,在反相色谱柱中溶质由于疏水作用而滞留的时间也将随着碳氢链的长度而增加。在一般情况下这意味着用碳氢链长的反相色谱柱能得到较好的分辩率,在多数情况下是依靠反复来选择色谱柱。由于反相色谱法的固定相是疏水的碳氢化合物,溶质与固定相之间的作用主要是非极性相互作用,或者说疏水相互作用,因此溶剂的强?#20154;?#30528;极性降低而增加。水是极性zui强的溶?#31890;?#20063;是反相色谱中zui弱的溶剂。在反相色谱中常常用和基础溶?#31890;?#21521;其中加入不同浓度的、可以与水混溶的有机溶?#31890;?#20197;得到不同强度的流动相,这些有机溶剂称为修饰剂。反相色谱中zui常用的有机溶剂有甲醇和乙腈,此外,乙醇、四氢呋喃、异丙?#25216;?#20108;氧六环也常被用作修饰剂。
     在生化分析中,反相色谱的应用极广。可用于①?#34987;?#37240;和多肽的分析;②蛋白质的分离;③碱基,核酸和核酸酶的分析;④甾体化合物的分析;⑤以及其他如?#35206;璺影?#31867;,组胺,糖及维生素的分离。
     (三)离子交换色谱
       离子交换色谱中的固定相是一些带电荷的基团,
     这些带电基团通过静电相互作用与带相反电荷的离子结合。如果流动相中存在其他带相反电荷的离子,按照质量作用定律,这些离子将与结合在固定相?#31995;?#21453;离子进行交换。固定相基团带正电荷的时候,其?#23665;换?#31163;子为阴离子,这种离子交换剂为阴离子交换?#31890;?#22266;定相的带电基团带负电荷,可用来与流动相交换的离子就是阳离子,这种离子交换剂叫做阳离子交换剂。阴离子交换柱的功能团主要是-NH2,及-MH3+:阳离子交换剂的功能团主要是-SO3H及-COOH。其中-NH3+离子交换柱及-SO3H离子交换剂属于强离子交换?#31890;?#23427;们在很广泛的pH?#27573;?#20869;都有离子交换能力;-NH2及-COOH
     离子交换柱属于弱离子交换?#31890;?#21482;有在?#27426;?#30340;pH值?#27573;?#20869;,才能有离子交换能力。离子交换色谱主要用于可电离化合物的分离,例如,?#34987;?#37240;自动分析仪中的色谱柱,多肽的分离、蛋白质的分离,核苷酸、核苷和各种碱基的分离等。
    
     二、易出现的问题
    
     (一)涡流扩散(Eddy diffusion)
       流动相碰到较大的固体颗粒,就像流水碰到石头一样产生涡流。如果柱装填得不均匀,有的部分松散或有细?#25285;?#21017;流动相的速度?#28034;歟?#26377;的部位结块或装直紧密则流就慢,多条流路有快有慢,就使区带变宽。因此,固相载体的颗粒要小而均匀,装柱要?#23665;?#22343;一,这样涡流扩散小,柱效率高。
     (二)分子扩散(Molecular diffusion)
       分子扩散就是物质分子由浓度高的区域向浓度低的区域运动,也?#35889;?#21521;分子扩散。要减少分子扩散就要采用小而均匀的固相颗粒装柱。同时在操作时,如果流速太慢,被分离物质停留时间长,则扩散?#29616;亍?br />     (三)质量转移(Mass transfer)
       被分离物质要在流动相与固定相中平衡,这样才能形?#23665;?#31364;的区带。在液相色谱中,溶质分子要在两个液相之间进行分配,或在固相上被吸附和解吸附均需要?#27426;?#30340;时间。当流速快时,转移速度慢,来不?#25353;?#21040;平衡动相就向前移,这各物质的非平衡移动,使区带变宽。
     (?#27169;?#21160;相流速
       当流速太低时,分子扩散?#29616;兀?#29305;别是在气相色谱中尤为突出。如将理论塔板高度对流速作图,理论塔板高?#20154;?#27969;速增加而急速下?#25285;贝?#21040;zui低值时,流速再加大则质量转移起主要作用,理论塔板高度又加大。在液相色谱中,流速稍快影响不大,但在凝胶过滤色谱中,因为物质要渗透到凝?#32791;?#37096;,所以质量转移影响大,流速咖大会降低柱效率。
     (五)固定相颗粒大小
       定相颗粒越小柱效率越高,对流动相流动的阻力越大,需要加大压力才能使它流动。

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